病毒检测中的福尔摩斯—基于CRISPR的SHERLOCK系统
摘要：对于流行性传染疾病，特别是具有一定潜伏时期（尤其是无症状或轻症状潜伏时期）的病毒感染，对患病人员的确诊都非常重要。无论是2003年的非典还是我们现在正在遭受的新型冠状病毒（COVID-19）疫情，如果能在感染初期或者轻症时期即可通过检测手段进行确诊，治愈几率及预后情况都会大大提高。
前言
对于流行性传染疾病，特别是具有一定潜伏时期（尤其是无症状或轻症状潜伏时期）的病毒感染，对患病人员的确诊都非常重要。无论是2003年的非典还是我们现在正在遭受的新型冠状病毒（COVID-19）疫情，如果能在感染初期或者轻症时期即可通过检测手段进行确诊，治愈几率及预后情况都会大大提高。
现有病毒检测试剂盒分类
1.胶体金免疫层析法（检测抗原）
每年冬天，很多人都会不可避免地感染上甲型或乙型流感。前往医院后医生会通过鼻咽拭子取样并快速确诊病患是否罹患该种病毒性感冒，而其能快速判断的依据就是甲流/乙流抗原快速检测试剂盒（胶体金法），这种试剂盒可以在较短时间内给与医生确定结果，而且操作非常简便。
免疫胶体金技术（Immune Colloidal Gold, ICG）是现有较为成熟的固相标记免疫测定技术，该技术以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，通过带颜色的胶体金颗粒来放大免疫反应系统，操作简单，标记明显，从而直观检测待测样品中的抗原或抗体，最快可以在15分钟内获得检测结果。
2.RT-PCR方法（检测核酸）
抗体的制备是需要一定时间通过研究和实验来获得，也需要多次的重复以确保检测的准确度。所以在此次新型冠状病毒中先采取荧光RT-PCR（实时荧光反转录聚合酶链式反应）进行检测。
通过鼻咽拭子取样，提取病毒基因组RNA，通过反转录形成cDNA，使用设计的特异性引物，以从DNA作为模板扩增病原体核酸序列。结果可通过结合在产物上的荧光染料信号强弱进行实时检测。
由于COVID-2019是一种新型冠状病毒，在获取它的全基因组序列后，我们就可以通过比对选取其中的特异区段，设计引物，进行检测。虽然这种方法需要的实验设计时间较短，机理清楚，但由于RT-PCR本身的特性（假阳性高、实验结果不稳定），再加上引物的结合效率、PCR程序优化程度等均会对检测结果产生影响。除此以外，此次新冠病毒主要在肺部浓度较高，在咽喉部浓度可能较低，这就导致鼻咽拭子取样后提取痕量RNA较为困难，这可能也是对患病人员进行核酸检测时会产生阴性结果的原因。
初显锋芒的SHERLOCK系统
提起张峰，生物界的人都不会陌生，作为麻省理工大学/哈佛Broad研究所的终身教授，他是基因组编辑领域（Genome Editing）的领军级人物之一，拥有多件CRISPR专利，曾经与同样是CRISPR领域的奠基人物Jannifer Doudna教授（加州伯克利分校）在CRISPR专利归属上有过纷争。
CRISPR/Cas系统有多种类型，其中Cas13尤为特殊，它是一类依赖于RNA靶向的RNA核酸酶，专一切割RNA，这一特性为RNA病毒的检测和治疗提供了便利。2017年，张峰在顶尖科研杂志SCIENCE上发表了《Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2》这篇文章(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5526198/)，首次介绍了SHERLOCK(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)技术，并且申请了多篇专利对该系统及其在诊断和治疗上的应用进行保护，其原理如下图所示。
Figure 1. SHERLOCK技术原理
为了抗击新冠病毒疫情，张峰教授同时公布了SHERLOCK系统的操作指南，并且在操作指南中设计了两个针对于冠状病毒的向导RNA和报告RNA，序列如下：
>S-crRNA_v1
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
>Orf1ab-crRNA
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCCAACCUCUUCUGUAAUUUUUAAACUAU
>Lateral-Flow-Reporter
5‘-/56FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/-3’
SHERLOCK系统相关专利情况
S-crRNA和Ofr1ab-crRNA是分别指向COVID-19的S蛋白和Orf1ab蛋白，Lateral-Flow-Reporter则是切割后可发出荧光的报告RNA。为了确保向导RNA可特异和靶向待检测病毒相结合，部分序列是需要和靶点互补，通过检索我们可以发现如图2所示，向导序列的前28bp均和此次COVID-2019相关序列100%匹配。
Figure 2. 向导RNA同COVID-19的匹配情况
将这三条重要序列同时在专利序列的数据库中进行比对，发现三条序列在专利里面的分布状况如图3所示：
Figure 3. 各条序列在专利中的分布情况
可见共有20篇相关专利同时包含这三条序列，点击进入后查看专利信息，所有专利的权利所有人均为张峰教授及其所在的Broad研究所，且均专注于基于CRISPR的诊断（图4）.
Figure 4. 序列检索获得的专利情况
根据比对，可见在WO2019051318，WO2019126577和WO2019071051这三篇专利里报告RNA均为100%匹配。以WO2019071051为例，该序列位于专利SEQ ID 451处，从专利原文的表格里可以看到相关序列（图5）.
Figure 5. Lateral flow reporter RNA在专利中所处位置
而S-crRNA和Orf1ab-crRNA的相似序列也在专利中出现，位于测试的crRNA的列表中（图6）
Figure 6. S-crRNA和Orf1ab-crRNA的相似序列在专利中所处位置
将20篇专利导入到Patbase中进行分析，这20篇专利分属于6个专利家族，均为PCT专利，处于进入国家阶段，如图7所示主要布局在美国、澳大利亚、加拿大和韩国，现仅有两件专利已在美国授权（US20180917546和US20180917549）。
Figure 7. SHERLOCK检测专利申请的国家布局状况和授权专利
这6个专利家族从核酸检测系统即CRISPR系统（包括起效蛋白、向导序列以及基于RNA的构建体）、其对病毒的检测方法、多种信号放大级联的CRISPR效应蛋白、横向流动的诊断装置、可检测多条靶点序列的CRISPR系统等多方面对该技术进行了相关保护。除去诊断方面用途，专利WO2019010422还保护了CRISPR系统对于抗病毒治疗的作用。 虽然相较于传统的real-time PCR技术来说，SHERLOCK技术具有灵敏度高、结果直观、准确度高、价格和检测时间低等优势，但真正应用到临床监测上还需要进行大量的实验，而张峰教授也明确在Protocol上注明该实验流程不能用于临床目的。无论怎样，SHERLOCK系统的存在为我们能够尽快检测出患病人员，特别是无症状感染者提供了参考。
数据库使用
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为了更多感兴趣的读者了解SHERLOCK系统，我们将SHERLOCK的实验流程、基于CRISPR的病毒检测系统专利（WO2018170340）及专利内所含有的全部序列（核酸及蛋白序列，FASTA格式）附于文章后，供大家参考。
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（作者：赵莉娜）
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